真核转录组测序

一、真核转录组

1. 组织样本

1.1 植物组织：

成熟部位,例如植物茎、根、种子等部位建议2倍以上

需要清洗的样本，可以无菌水或75%乙醇冲洗表面，吸水纸吸干

样本离体后，在冰上立即分割50-100mg小块，2-3管备份，放置冻存管并立即液氮速冻，放置-80℃保存,避免未经速冻直接放-80℃保存

不建议使用RNAlater等RNA 保护试剂保存植物组织样品；因为植物细胞含有细胞壁，RNA保护试剂很难渗透

不建议使用TRIzol保存；TRIzol法并不适用于萃取大多数植物样本，植物组织中的RNA提取多采用专门的提取试剂盒，而TRIzol保存会影响试剂盒提取液的提取效果

1.2 动物组织：

对于动物组织，选用新鲜样本，采集样品时应选取核酸含量较多的部位；核酸不丰富部位,例如脂肪、成熟皮肤、骨头等部位增加采样量。

生理盐水漂洗；剔除结缔组织等非研究组织。

样本离体后，在冰上立即分割50-100mg小块，2-3管备份，放置冻存管并立即液氮速冻，放置-80℃保存,避免未经速冻直接放-80℃保存。

无法及时用液氮速冻保存的样本，可采用RNAlater等RNA保护液，注意完全按照RNA保护液操作，尽量使组织块尺寸保持在5mm左右，过小不利于样本收集，过大则保护液不能均匀的渗透到组织。切记不可先-80℃冻存后取出放入RNAlater浸润。

动物样本可加裂解液（TRIzol,或其他同TRIzol使用方法一致的裂解液）；如果使用TRIzol裂解液保存，请务必先进行液氮研磨破碎，然后溶于TRIzol中液氮速冻；-80℃保存。

1.3 细胞样本

生长状态良好的悬浮细胞或贴壁细胞。

悬浮细胞：每5×10⁶个细胞加入1ml TRIzol试剂，用枪头反复抽打细胞，直至看不见成团的细胞块，整个溶液呈清亮而不粘稠的状态；转移到的离心管中，液氮速冻，放置-80℃保存

贴壁细胞按每10cm²培养面积（相当于六孔板一个孔或35mm直径培养皿）加1ml TRIzol试剂；用枪头反复吹打，使TRIzol接触所有长有细胞的培养瓶表面，并进行充分消化，反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块；转移到离心管中，液氮速冻，放置-80℃保存

此外，也可将细胞用PBS缓冲液快速洗一次，离心之后收集得到细胞沉淀，液氮速冻，放置-80℃保存

1.4 血液样本

常见血液样本处理方法：

（1）TRIzol法；

（2）PAXgene RNA tube法（全血样本更推荐此保存方法）；

（3）离心分离得到白细胞或者PBMC。

除上述三种外，全血样本也可不做处理，直接液氮速冻，但由于血液中RNA含量低，同时血细胞容易破裂、释放RNA酶，造成RNA降解，所以提取成功率低

TRIzol法：先把血液放到抗凝管里，震荡混匀，使血液和抗凝剂充分混合，再抽出一部分和TRIzol混匀，TRIzol和血的比例=3：1，震荡混匀，不要有血块，液氮速冻，-80℃冻存，干冰运输

 因转录组测序分析对RNA质量要求较高，建议30天内进行RNA提取

1.5 菌体

建议收集液体培养基中对数生长期的菌体

通过低速离心收集菌体并尽可能将培养基去除干净，然后用无菌水或PBS缓冲液冲洗样品1~3遍，送菌液沉淀

不建议用RNAlater保存，因为RNAlater密度较大，取时不易分离菌体

不建议加入裂解液，细菌的提取一般使用试剂盒

不建议加TRIzol，影响菌体裂解

1.6 FFPE样本

福尔马林固定后石蜡包埋的组织简称为FFPE样品

要求：

1.6.1 厚度在5-10μm，组织面积大于25mm2的切片12张；

1.6.2 FFPE样本常温或者冰袋运输即可

样本准备建议：

1）获得样本后，尽快开始固定；

2）将样本切薄再浸泡（5-10um或更薄最好）；

3）避免过度固定，浸泡时间过长；

4）纯化的样品最好是固定或者包埋时间在半年内的样本，放置时间越长，对RNA纯化越不利

提示：为保证实验的顺利，建议样本备份1-2份，以防备部分样本降解。

2. 核酸样本

• 针对核酸有杂质、污染、粘稠、颜色等情况，需要过柱纯化，或增加采样量

• 核酸样品建议使用1.5ml、2ml EP管装载样品，其他保存管容易破裂且不利于保存样品和后续实验的开展

• 为了防止样品污染和混淆，禁止使用96孔板和深孔板装载样品

• 用乙醇沉淀的样品由于运输中会有少量乙醇挥发，建议将样品管盖用封口膜缠绕4-5圈

total RNA ：普通转录组文库：浓度：≥ 50ng/μL，体积在20μL ~120μL，总量：≥ 800ng

                    真核链特文库： 浓度：≥ 50ng/μL，体积在20μL ~ 120μL，总量：≥ 800ng

二、样本打包

1. 样本的打包

（1）核酸样品建议使用质量好的1.5ml或2ml 低吸附EP管装载样品，并用封口膜封口。为了防止样品管破裂，或者污染和混乱，不要使用诸如PCR管、0.5ml EP管、八联管、96孔板、深孔板等非标准管。非标准管不利于样品保存以及后续实验的进行。

（2）组织样本建议根据采样量使用合适规格带螺纹帽的EP管、冻存管或者离心管装载组织样品，并用封口膜封口。

（3）为防止样品管在运输过程中受到干冰挤压破裂，最好将样品管放到50ml离心管或其他支撑物中，并在支撑物里添加棉花或卫生纸缓冲。大量样品建议将EP管放置在冻存盒中，并在冻存盒外面包裹气泡垫。如使用锡箔纸、自封袋装载的样品，为防止运输中受挤压破损，建议将锡箔纸折叠整齐装在自封袋中，在样品包装外再用气泡垫包好并固定。

（4）对于血液样品，建议采用5-10ml 塑料抗凝采血管装载，为了防止运输过程中采血管因挤压而损坏，需要将每支采血管管身均用气泡垫包好，然后放置到塑料或纸质包装盒中。

（5）用乙醇沉淀的样品由于运输中会有少量乙醇挥发出，建议将样品管盖用封口膜缠绕4-5圈。

2. 样本的名称标识

（1）所有的样品必须具有清晰的标记，并且简洁明了。

（2）使用锡箔纸包装的组织样品建议在锡箔纸内外均标记样品名称，并将锡箔纸放在自封袋中，自封袋外面再标记上样品名称，防止锡箔纸上样品名称模糊引起样品混乱。

（3）使用乙醇沉淀的核酸样品，由于挥发出的乙醇会使记号笔的标记模糊，建议用油性记号笔将样品名称写在标签纸上，然后用透明胶带将标签纸粘贴在样品管壁上，并缠绕2-3圈。

（4）样品名称建议使用“字母+数字”命名方式标注在管盖。其他信息如日期、浓度、物种等可标注在管壁。所有标注内容需与《样品信息单》保持一致。