一、真核转录组
1. 组织样本
1.1 植物组织:
成熟部位,例如植物茎、根、种子等部位建议2倍以上
需要清洗的样本,可以无菌水或75%乙醇冲洗表面,吸水纸吸干
样本离体后,在冰上立即分割50-100mg小块,2-3管备份,放置冻存管并立即液氮速冻,放置-80℃保存,避免未经速冻直接放-80℃保存
不建议使用RNAlater等RNA 保护试剂保存植物组织样品;因为植物细胞含有细胞壁,RNA保护试剂很难渗透
不建议使用TRIzol保存;TRIzol法并不适用于萃取大多数植物样本,植物组织中的RNA提取多采用专门的提取试剂盒,而TRIzol保存会影响试剂盒提取液的提取效果
1.2 动物组织:
对于动物组织,选用新鲜样本,采集样品时应选取核酸含量较多的部位;核酸不丰富部位,例如脂肪、成熟皮肤、骨头等部位增加采样量。
生理盐水漂洗;剔除结缔组织等非研究组织。
样本离体后,在冰上立即分割50-100mg小块,2-3管备份,放置冻存管并立即液氮速冻,放置-80℃保存,避免未经速冻直接放-80℃保存。
无法及时用液氮速冻保存的样本,可采用RNAlater等RNA保护液,注意完全按照RNA保护液操作,尽量使组织块尺寸保持在5mm左右,过小不利于样本收集,过大则保护液不能均匀的渗透到组织。切记不可先-80℃冻存后取出放入RNAlater浸润。
动物样本可加裂解液(TRIzol,或其他同TRIzol使用方法一致的裂解液);如果使用TRIzol裂解液保存,请务必先进行液氮研磨破碎,然后溶于TRIzol中液氮速冻;-80℃保存。
1.3 细胞样本
生长状态良好的悬浮细胞或贴壁细胞。
悬浮细胞:每5×106个细胞加入1ml TRIzol试剂,用枪头反复抽打细胞,直至看不见成团的细胞块,整个溶液呈清亮而不粘稠的状态;转移到的离心管中,液氮速冻,放置-80℃保存
贴壁细胞按每10cm2培养面积(相当于六孔板一个孔或35mm直径培养皿)加1ml TRIzol试剂;用枪头反复吹打,使TRIzol接触所有长有细胞的培养瓶表面,并进行充分消化,反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块;转移到离心管中,液氮速冻,放置-80℃保存
此外,也可将细胞用PBS缓冲液快速洗一次,离心之后收集得到细胞沉淀,液氮速冻,放置-80℃保存
1.4 血液样本
常见血液样本处理方法:
(1)TRIzol法;
(2)PAXgene RNA tube法(全血样本更推荐此保存方法);
(3)离心分离得到白细胞或者PBMC。
除上述三种外,全血样本也可不做处理,直接液氮速冻,但由于血液中RNA含量低,同时血细胞容易破裂、释放RNA酶,造成RNA降解,所以提取成功率低
TRIzol法:先把血液放到抗凝管里,震荡混匀,使血液和抗凝剂充分混合,再抽出一部分和TRIzol混匀,TRIzol和血的比例=3:1,震荡混匀,不要有血块,液氮速冻,-80℃冻存,干冰运输
因转录组测序分析对RNA质量要求较高,建议30天内进行RNA提取
1.5 菌体
建议收集液体培养基中对数生长期的菌体
通过低速离心收集菌体并尽可能将培养基去除干净,然后用无菌水或PBS缓冲液冲洗样品1~3遍,送菌液沉淀
不建议用RNAlater保存,因为RNAlater密度较大,取时不易分离菌体
不建议加入裂解液,细菌的提取一般使用试剂盒
不建议加TRIzol,影响菌体裂解
1.6 FFPE样本
福尔马林固定后石蜡包埋的组织简称为FFPE样品
要求:
1.6.1 厚度在5-10μm,组织面积大于25mm2的切片12张;
1.6.2 FFPE样本常温或者冰袋运输即可
样本准备建议:
1)获得样本后,尽快开始固定;
2)将样本切薄再浸泡(5-10um或更薄最好);
3)避免过度固定,浸泡时间过长;
4)纯化的样品最好是固定或者包埋时间在半年内的样本,放置时间越长,对RNA纯化越不利
提示:为保证实验的顺利,建议样本备份1-2份,以防备部分样本降解。
样本类型 | 核链特转录组 |
新鲜植物组织干重 叶片、花 | ≥ 0.3g; 根、茎、种子等其他组织 ≥ 0.5g |
新鲜动物组织干重 内脏组织、脑组织 | ≥ 0.08g; 脂肪、皮肤、骨头、血管等其他组织 ≥ 0.3 |
新鲜培养细胞 | >≥5*106个 |
新采集的全血(加入 TRIzol) | >≥5mL |
新采集的全血 (液氮速冻) | >≥2mL |
PAXgene 采血管 | ≥1 管 |
石蜡切片 | 厚度在5-10μm,含组织面积大于25mm2的切片12张 |
菌体/菌丝 | >3*106个/>0.3g |
半固体细菌 | ≥ 0.5mL |
2. 核酸样本
• 针对核酸有杂质、污染、粘稠、颜色等情况,需要过柱纯化,或增加采样量
• 核酸样品建议使用1.5ml、2ml EP管装载样品,其他保存管容易破裂且不利于保存样品和后续实验的开展
• 为了防止样品污染和混淆,禁止使用96孔板和深孔板装载样品
• 用乙醇沉淀的样品由于运输中会有少量乙醇挥发,建议将样品管盖用封口膜缠绕4-5圈
total RNA :普通转录组文库:浓度:≥ 50ng/μL,体积在20μL ~120μL,总量:≥ 800ng
真核链特文库: 浓度:≥ 50ng/μL,体积在20μL ~ 120μL,总量:≥ 800ng
二、样本打包
1. 样本的打包
(1)核酸样品建议使用质量好的1.5ml或2ml 低吸附EP管装载样品,并用封口膜封口。为了防止样品管破裂,或者污染和混乱,不要使用诸如PCR管、0.5ml EP管、八联管、96孔板、深孔板等非标准管。非标准管不利于样品保存以及后续实验的进行。
(2)组织样本建议根据采样量使用合适规格带螺纹帽的EP管、冻存管或者离心管装载组织样品,并用封口膜封口。
(3)为防止样品管在运输过程中受到干冰挤压破裂,最好将样品管放到50ml离心管或其他支撑物中,并在支撑物里添加棉花或卫生纸缓冲。大量样品建议将EP管放置在冻存盒中,并在冻存盒外面包裹气泡垫。如使用锡箔纸、自封袋装载的样品,为防止运输中受挤压破损,建议将锡箔纸折叠整齐装在自封袋中,在样品包装外再用气泡垫包好并固定。
(4)对于血液样品,建议采用5-10ml 塑料抗凝采血管装载,为了防止运输过程中采血管因挤压而损坏,需要将每支采血管管身均用气泡垫包好,然后放置到塑料或纸质包装盒中。
(5)用乙醇沉淀的样品由于运输中会有少量乙醇挥发出,建议将样品管盖用封口膜缠绕4-5圈。
2. 样本的名称标识
(1)所有的样品必须具有清晰的标记,并且简洁明了。
(2)使用锡箔纸包装的组织样品建议在锡箔纸内外均标记样品名称,并将锡箔纸放在自封袋中,自封袋外面再标记上样品名称,防止锡箔纸上样品名称模糊引起样品混乱。
(3)使用乙醇沉淀的核酸样品,由于挥发出的乙醇会使记号笔的标记模糊,建议用油性记号笔将样品名称写在标签纸上,然后用透明胶带将标签纸粘贴在样品管壁上,并缠绕2-3圈。
(4)样品名称建议使用“字母+数字”命名方式标注在管盖。其他信息如日期、浓度、物种等可标注在管壁。所有标注内容需与《样品信息单》保持一致。