代谢组学

1. 送样要求

备注 细胞保证数目一致，菌体为菌体沉淀

注：请使用1.5mL的进口离心管进行样本分装。

2. 外泌体鉴定及代谢检测送样要求

注：目前仅提供超速离心法富集外泌体。

3. 样本的预处理

3.1 动物组织类代谢组学样本处理方法

3.1.1 组织样本处理步骤

1）动物组织样本：若取整个组织采用灌流法，用预冷的去离子水去除组织中的血液残留；若取部分组织则在破碎组织后用预冷的去离子水漂洗掉血液残留；

人组织样本：小的活检样本，快速用预冷的去离子水冲洗，去除血液残留；

2）根据具体实验设计取特定的部位，250 mg/sample 装入离心管中；

3）做好标记后迅速放入液氮中冷冻处理至少15min；

4）-80°C冰箱冻存。足量干冰寄送。

3.1.2 注意事项

1）生物学重复取样部位尽量保持一致；

2）组织样本收集处理过程中注意避免麻醉、Ep管、收集器械等的污染；

3）样本收集应快速、冰上进行操作，尽量减少在-20℃或-80℃冰箱中保存时间；

4）及时分装样本，避免反复冻融。 

3.2 细胞代谢组学样本处理方法

3.2.1 细胞样本处理步骤

1）悬浮细胞样本：离心收集悬浮细胞，用预冷的PBS快速清洗 2～3次，4°C，1000g低速离心1min，弃去上清，收集细胞（细胞沉淀50μL）于1.5mL进口离心管中，液氮速冻15min，-80°C保存，足量干冰运输。

2）贴壁细胞样本（非靶&类靶）：将培养的细胞去除旧培养基，用预冷的PBS清洗2～3次，弃去上清，后加入0.5ml 胰酶消化，最后用预冷的PBS溶液清洗细胞2-3遍终止胰酶的作用，转入进口离心管中，4°C，1000g低速离心1min，弃去上清，收集细胞于1.5mL进口离心管中，液氮速冻15min，-80保存，足量干冰运输。（设置复孔采用胰酶消化法进行细胞计数）

3）靶向代谢贴壁细胞样本：将培养的细胞去除旧培养基，用预冷的PBS清洗2～3次，再加入少量PBS，用细胞铲刮下细胞，置于1.5mL离心管中，4℃，1000g低速离心1min，弃去上清，收集细胞于1.5mL进口离心管中，液氮速冻15min，-80°C保存，足量干冰运输。（设置复孔采用胰酶消化法进行细胞计数）

4）代谢流送样建议

悬浮细胞：①用细胞计数板或可比较的系统计数细胞，再用吸管从培养皿把含有细胞的培养基转移到离心管中（在干冰中或干冰/乙醇浴中）；②离心（0℃，1000g离心2分钟），再用吸管或者移液器弃去培养基；③向离心管中加入1毫升冰冷PBS缓冲液，洗涤细胞（1-3次），离心（0℃，1000g离心2分钟），用吸管或者移液器弃去洗涤液；④样本冻存于-80℃环境，足量干冰寄送。

贴壁细胞：①从培养箱中取出细胞（本处默认6孔板，或6cm或10cm培养皿或细胞培养瓶），置冰上，弃去培养液，或收集培养液并冻存于-80℃或液氮以用于培养液成分检测（胞外分泌物）；②向（置冰上的）细胞培养板的每孔中分别加入1mL冰冷PBS缓冲液（默认6孔板），洗涤细胞（1-3次），弃洗涤液，暂存于冰上；③加液氮覆盖细胞，以迅速停止细胞活性（此步可选，但是最有效）；④加400μL冰冷甲醇（如果使用液氮，需待液氮挥发后加），轻轻打旋以确保所有细胞被甲醇覆盖，封盖，放-80℃冰箱中保存30分钟以上；⑤加100μL预冷的超纯水，轻轻混匀；⑥使用合适的细胞铲刮细胞，使90%以上细胞脱离培养材料而进到甲醇水悬浮液中，将细胞连同溶剂一起收集到合适的密封良好的旋盖离心管或细胞冻存管中；⑦加200μL冰冷80%甲醇水溶液洗涤细胞残渣，收集洗涤液并与此前收集的样本合并。样本冻存于-80℃环境，足量干冰寄送。

3.2.2细胞培养基（研究细胞外代谢）处理步骤

将培养的细胞去除旧培养基，用PBS清洗2-3遍，然后加入无血清培养基继续培养一段时间，根据实验设计或细胞状态选择合适时间吸取大于5mL贴壁细胞的培养基，1000g，4°C离心 1min，取全部上清，液氮速冻15min，冻存到－80°C冰箱内，足量干冰寄送。

3.2.3细胞培养上清液处理步骤

培养细胞去除旧培养基，用PBS清洗2-3遍，然后加入无血清培养基继续培养一段时间。根据实验设计或细胞培养状态选择合适时间收集细胞上清。4℃， 1000 g，离心10 min去除细胞， 收集上清。4℃， 10000 g， 离心10min去掉细胞碎片，取上清分装到1.5mL的离心管中， 液氮速冻，－80°C冻存。

3.2.4注意事项

1）每个样本收集细胞数目尽量保证一致，上述整个过程需尽量迅速完成。

2）培养基类型影响代谢物的种类，需保证细胞培养过程中培养基类型一致。

3）研究胞外代谢，在保证细胞存活率的情况下请使用无血清培养基。

4）将每个样本做好标记。

5）贴壁细胞PBS冲洗后尽可能去除干净上清，保证后续加入1mL甲醇水溶液后各样本的样本量一致。

3.3 血浆、血清代谢组学样本处理方法

3.3.1血浆样本处理步骤

推荐使用肝素钠抗凝管采集全血，并尽快进行血浆分离：3000rpm 4°C离心 10min, 取上层，0.2mL/管分装至1.5 mL 离心管中。做好标记后，液氮速冻15 min，-80°C冰箱冻存。足量干冰寄送。

3.3.2血清样本处理步骤

血液收集在离心管或真空采血管中 37°C（或室温）静置 1h 进行凝固分层。然后 3000rpm 离心5min，取上清转至干净的离心管中。再 12000rpm 4°C离心 10min（也可只进行一次离心后完成取样），取上清分装到1.5 mL离心管中，每管 0.2mL，做好标记后，液氮速冻15min，-80°C冰箱冻存。足量干冰寄送。

3.3.3注意事项

1）取样前动物样本禁食不禁水至少10h，临床样本取样前3天，注意饮食清淡，取样前一天8点以后禁食禁水。样本处理过程尽量保持一致，包括样本放置时间、离心时间等。

2）取血时如用酒精消毒，请擦干擦拭部位，待酒精完全挥发后再取样。

3）采血管选择：血浆：推荐使用肝素钠抗凝管（绿色头盖），柠檬酸钠抗凝剂（蓝色或黑色头盖）与EDTA抗凝剂（紫色头盖）会对代谢物产生干扰及基质效应，但EDTA抗凝管的干扰可以通过对样本进行脱盐操作消除影响，使用EDTA抗凝管请提前进行备注。血清：采血时请使用不加抗凝剂的真空采血管（红色盖头）。

4）建议尽量多收集样本并使用1.5mL离心管分装冻存，切记避免反复冻融。

5）血清参考得率：30%~50%（例如：1mL 全血大约能得 0.3~0.5mL 血清）；血浆参考得率：≈50%（例如：1mL 全血大约能得 0.5mL 血浆）。

6）若样本出现溶血问题，请参考比色卡，样本颜色为红色时溶血现象较为严重，不适合继续做代谢组学实验，需重新收集样本。

3.3.4参考文献

3.4 唾液代谢组学样本处理方法

3.4.1 样本处理步骤

上午9:30-11:30取样，用生理盐水漱口后，将唾液外吐于无菌痰杯内（保持冰浴），不要咳痰，短时间内收集足量样本，4℃，2000g离心10min，取上清，再经0.22μm滤膜过滤除菌（可不过滤），分装2-3管，液氮速冻15min，保存于-80℃，足量干冰寄送。

3.4.2 注意事项

1）禁食禁烟禁酒1h以上，取样前不要刷牙。

2）建议尽量多收集样本并使用1.5mL离心管分装冻存，切记避免反复冻融。

3.5 尿液代谢组学样本处理方法

3.5.1 样本处理步骤

晨起中段尿（临床）或晨间 1h 尿（动物），3000rpm，4°C离心10min，取澄清尿液，分装到离心管中，每管500μL，做好标记后，液氮速冻15min，-80°C冰箱冻存，足量干冰寄送。

3.5.2 注意事项

1）若动物1h 尿量不够，可分多次收集，如果需要收取24h尿液，请使用带有低温装置的代谢笼收取，并添加叠氮化钠（0.05～0.1%w/v）。

2）叠氮化钠的作用是防腐杀菌，有毒，请万分小心。

3.6 眼泪代谢组学样本处理方法

3.6.1样本处理步骤

上午9：00-12：00之间取样。请受试者眼睛向上看，用准备好的Schirmer试纸，将具有圆弧度的一端夹持于眼睑外1/3处结膜囊内，另一端挂于眼外，请受试者轻轻闭眼。收集时间为5min，取下的试纸放入1.5 mL离心管中，液氮速冻15min。保存于-80℃直至送样，足量干冰寄送样本。

3.6.2注意事项

每天每只眼睛采集的眼泪样品不超过一个。

3.7 粪便、肠道内容物代谢组学样本处理方法

3.7.1 样本处理步骤

收集到新鲜粪便或肠道内容物样本后，分装样本250mg/管，然后立即用液氮速冻处理15min，做好标记后保存至-80°C冰箱，足量干冰寄送。

3.7.2 注意事项

由于粪便/肠道内容物中有非常多的微生物，微生物代谢速度非常快，所以反复冻融会对代谢水平有非常大影响。建议样本收集后，按照250mg/sample 进行分装冻存。

3.8 拭子代谢组学样本处理方法

3.8.1 样本处理步骤

1）阴道拭子:尽可能使明亮的光线照进被采样者阴道，将洁净的拭子（已称重）轻轻插入阴道内部，停留片刻后缓慢转动后退出。将拭子头置入离心管中，尾部弃去，拧紧盖子，液氮速冻15min。保存于-80℃直至送样，足量干冰寄送样本。

2）咽拭子:明亮的光线从检查者肩膀上方照射进张开的口腔，让患者深呼吸，然后发“啊”音，用压舌板轻轻压舌，再用洁净的咽拭子（已称重）来回擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，然后将拭子头置于离心管中，尾部弃去，拧紧盖子。

3）鼻拭子:尽可能使明亮的光线照进鼻腔，将洁净的鼻咽拭子（已称重）轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。以另一拭子拭另侧鼻孔。将拭子头置于离心管中，尾部弃去，拧紧盖子。

4）牙菌斑:取样前天晚上不要刷牙，第二天早上在未进食前取样。首先用无菌生理盐水冲洗收集区，棉卷隔湿，之后根据实验目的，用采集拭子分别采集牙齿的舌面、唇面、龋齿损伤区域等部位的牙菌斑。采集时建议由同一操作者进行牙菌斑采集操作，在同一部位来回刮擦3-4次，每个样本均采用一个采集拭子进行采集。采集完成后，将拭子放到离心管里15min。保存于-80℃直至送样，足量干冰寄送样本。

3.8.2 注意事项

1）取样前后对拭子进行称重，用以确定取样量。

2）咽喉取样时，拭子不能接触到口腔和舌粘膜。

3）取样时间最好在发病 72 小时内，晨起后。

3.9 微生物代谢组学样本处理方法

3.9.1 微生物菌体取样步骤

采用离心法收集菌体（保证离心后菌体的体积一致），用预冷的PBS快速冲洗2-3次，每次清洗后4°C，5000rpm，离心5min；将上清完全弃去，菌体收集在1.5 mL进口离心管（冻存管）中，液氮速冻15min，-80°C保存，足量干冰运输。

3.9.2 微生物培养液（研究胞外代谢）取样步骤

培养好的菌液混匀后，取大于5mL的菌液，3000rpm，4°C离心 10min，取全部上清，液氮速冻15min，冻存到－80°C冰箱内，足量干冰寄送。

3.9.3 微生物固体培养基取样步骤

用刀片将培养基切成正方形片，液氮速冻15min，冻存-80℃冰箱内，足量干冰寄送。

3.9.4 注意事项

1）微生物代谢速度非常快，所以所有的步骤需要尽快完成；

2）不同样本间菌体数量要保持一致；

3）一般OD600在0.6～0.8之间表明细菌处于对数生长期，经验浓度为108/mL，需根据具体情况确认。

3.10 植物类代谢组学样本处理方法

3.10.1 叶片、茎、花

3.10.1.1 样本处理步骤

取整片叶片/一段茎/一朵花，用锡箔纸包裹并标记后，迅速放入液氮中冷冻处理至少 15min。取出后迅速放入自封袋中（每组一袋），在自封袋中放入标签纸注明样本信息。迅速放入-80°C 冰箱冻存。足量干冰寄送。

3.10.1.2 注意事项

1）采集叶片样本时，最好在中午光照好的时间收集。

2）根据实验设计，采集样本时保持样本一致性，尤其是同一组样本（颜色、衰老程度、叶脉占比、光照、位置等）。

3）由于锡箔纸上 marker 笔标记容易模糊，所以建议同时在自封袋中放入标签纸注明。

3.10.2 根

3.10.2.1 样本处理步骤

1）取整株植物的根部，迅速用 1×PBS 漂洗掉根上的泥土。

2）根据具体实验设计取植株根特定的部位，500mg/sample 装入离心管中。

3）做好标记后迅速放入液氮中冷冻处理至少 15min。

4）-80°C冰箱冻存。足量干冰寄送。

3.10.2.2 注意事项

1）PBS 漂洗时间要尽快；

2）由于根部组织特别脆弱，被挤压后会变成浆糊状，所以推荐保存至离心管中, 不建议用锡箔纸包裹。

3.10.3 果实、种子

3.10.3.1 样本处理步骤

1）对于含多汁、块头较大的果实（番茄、西瓜、苹果等）需要先用锋利的刀分割成“均匀”合适的小块（≈250mg/sample）分装至 1.5mL 离心管中，做好标记后迅速放入液氮中冷冻处理至少15min。

2）对于细小的颗粒种子（拟南芥种子、谷物种子等），可以先将同一组的植株种子混匀后再分装（≈250mg/sample）至1.5 mL 离心管中。做好标记后迅速放入液氮中冷冻处理至少 15min。

3）对于要求对整个果实进行提取的（整粒葡萄等），需要把果实装在 50mL 离心管中/自封袋中，做好标记后（同时放入自封袋中标签纸，注明样本信息）迅速放入液氮中冷冻处理至少 15min。

3.10.3.2 注意事项

1）对多汁的果实进行取样很难保持均一性（如番茄、皮、果肉、果瓤、籽的占比）, 强烈建议将整个果实进行研磨、冻干，对粉末进行称重分装。

2）不推荐用锡箔纸包裹。

3.11 土壤代谢组学样本处理方法

3.11.1 土壤样本取样步骤

将收集到的土壤样本用离心管收集，冷冻干燥，去除多余水分；将土壤进行过筛处理：使用2mm土壤筛以中速振动2分钟，并用容器收集；将收集到的样本每1g放入进口离心管（冻存管）中，液氮速冻15min，-80°C保存，足量干冰运输。

3.11.2 根系分泌物样本取样步骤

实验室培养植物：选择长势良好的幼苗，并使用去离子水根部以去除残留土壤，将幼苗放置于培养液中培养1-2个月，选择并取出其中生长状况良好的植株，使用去离子水反复清洗根部2-3次以去除营养液的残留成分；之后将植株用适量去离子水培养24h（注意根部避光）；混合3个及以上单株植株的水培液体，过滤，真空蒸干，并于-80℃保存。

田间作物：取田间长势良好的单作植株，挖出植株完整的根系，给根系套袋后埋回原处处理72h；取出初步处理植株，用去离子水充分清洗根系后用湿润的滤纸包裹根系，使用去离子水保持滤纸的湿润，将包裹的植株置于50ml离心管中，用封口膜封住管口后将离心管埋回原处；处理24h后，截取滤纸覆盖的根系，用冰盒暂时保存至实验室后，加入100ml的去离子水进行震荡提取30分钟，最后将液体进行抽滤后进行蒸发浓缩，最终液体或者干粉保存于-80℃待测。

3.11.3 注意事项

土壤筛和收集容器均需用70%乙醇进行擦拭，并保证使用时是干燥的。

4. 空间代谢组样本制备

①组织样本

（1）不用包埋的组织（一般为含水量比较少的组织，如脑、肝、肾、心、脾、皮肤、胰腺、肿瘤组织等）

取组织样本（不超过载玻片大小25*75mm），尽量保证组织的完整性，用铝箔做一个锡箔纸小船，将组织平放于锡箔纸小船内（注意将要切的平面朝向锡箔纸小船底部使之保持平放）。将放好组织的锡箔纸小船置于液氮溶液上15 - 30 s，待看到组织完全变白，即可取出锡箔纸小船。将样品于-80℃冰箱保存，干冰进行运输。

（2）需要包埋的组织（一般为含水量或空腔比较多的组织，含水量多的组织为了保证切片时切片的完整性需要进行包埋，如眼球、肺组织、大多数植物组织的根、茎、种子、胚珠）

取组织样本（不超过载玻片大小25*75mm），尽量保证组织的完整性，配制包埋剂溶液，可选1%~2%（质量体积比）的羧甲基纤维素（CMC）；10%-25%（质量体积比）的明胶（购买低中粘度的）；羟丙基甲基纤维素（HPMC）+聚乙烯吡咯烷酮（PVP）三种包埋剂之一，不能用OCT作为包埋剂（离子化时会抑制离子电离且出现干扰峰）。先加1mL的包埋剂（包埋剂中尽量不要有气泡）平铺在包埋盒中，将组织置于包埋剂中，并调整好组织的位置（组织在包埋盒中放置的位置与后续切片的平面有关），再加适量包埋剂覆盖在组织上，确保组织完全被覆盖，随后将包埋盒置于干冰乙醇浴中冷冻。待包埋剂完全变白后（该冷冻过程约3-5min），即可取出包埋盒于-80°C冰箱保存，干冰进行运输。

（3）对于植物叶片组织。由于其非常薄，通常叶片不进行切片，压片干燥后进行后续检测，叶片寄样时为了保证叶片平整及目标物稳定，送样流程如下：将一片叶片取下后平整放于两块铝箔中间，然后置于冻存盒内，然后将冻存盒置于干冰中进行运输。

②切片

（1）福尔马林固定石蜡包埋、染色剂如HE染色等处理后的样品，对质谱检测有一定影响，不建议进行空间代谢组检测；

（2）切片厚度大约在8~20微米（一般为12um），切片大小不超过15*65mm，对比样品可放置于同一张ITO（单面导电载玻片）玻片上以保持处理过程一致，同玻片上切片间应留有一定空隙，同一种样本在同一ITO玻片上至少提供1个组织切片以用于成像前的校准及激光能量参数调节；

（3）切片流程如下：经-80°C冰箱取出的组织放于-20°C冰箱或切片机里-20°C平衡1小时。将样品固定到样品托头上（对于非包埋样本，用水作为固定剂，具体操作为用移液器吸取超纯水于圆形样品托头上，并将组织放在水上由于负20度环境待水结冰后组织就固定了，注意事项：放组织时应尽可能将要切的平面保持向上并水平。对于包埋样本，切片时用包埋剂来替代水作为固定剂，步骤与非包埋样本一致，如用10%明胶包埋的胚珠，则用10%明胶作为固定剂），然后把样品托头固定在切片机可定位样品头上，调整好样品的角度和方位，按照切片机使用说明书操作进行切片，将切好的切片用预冷的毛刷转移到预冷的ITO玻片上，将玻片背面贴紧手背，用手背的温度将组织切片融化至透明，透明后通过手指摩擦玻片背面，通过背面的温度将玻片正面组织上的水分蒸干，组织会由透明变白。切完后将含有组织的玻片用真空干燥仪器干燥20min。然后放入-80°C保存，干冰进行运输。