三代DNA测序

1. 植物

1.1 植物样本说明

（1）植物样本主要包括禾本科植物、十字花科、常见作物、林木、常见蔬菜和花卉、中药、蕨类或苔藓。

（2）样本的取材优先选择核酸含量相对较高的组织，幼嫩的组织最佳，如幼叶，幼芽。由于组培苗的愈伤组织DNA不稳定，组培苗在个别分析中不建议使用。

（3）制备冻存幼嫩组织样本时，要求选取新鲜幼嫩叶片或嫩芽组织部位，避免根茎组织。含多糖多酚的植物备注样本为多糖或多酚，当天进行提取；长时间冻存样本提取得率差，尽量避免该类样本。

（4）冷冻样本运输：选取幼嫩无病虫害的组织部位（如幼叶），新鲜组织摘取后，立即进行表面消毒。可依次使用75%酒精冲洗-无菌水冲洗，用吸水纸吸干多余水份。使用剪刀去除木质化严重的部位（如叶脉）。液氮冻存前，进行分装。将组织放入预冷的冻存管、15ml或50ml离心管或者自封袋中，液氮速冻，然后-80℃保存。如用锡箔纸包装组织样品，折叠时需有纹理可循，并将锡箔纸放入自封袋中，避免打开锡箔纸时样品洒落，干冰运输。

（5）建议在采集样本之前，将样本置于黑暗环境24-48小时后再制备样本。

1.2 常规植物组织样品（不同DNA文库）

1.2.1 三代DNA测序

部分物种样本组织量建议（去除包装后的重量），参考下表；其中用于Ultra long ONT测序样本：必须是嫩叶或嫩芽，如果物种种子萌发条件简单，可使用刚萌发的幼苗进行后续实验。  

1.2.2 Hi-C测序

（1）组织样品需求量（单个Hi-C文库在Illumina平台最高200G）：>1g，送样量>3g最优；

（2）样品制备：优选一叶或者两叶苗期的全部植株或者部分植物组织；对于富含多酚类的物种最好提供子叶组织；若为成熟植株，选择幼嫩叶，或是除幼嫩叶片外的其他幼嫩组织，避免根茎；其次是提供在黑暗条件处理2-3天的植物组织。

1.2.3 BioNano测序

（1）组织样品需求量（单cell，原始产出500G）：>1g，送样量>3g最优；

（2）样品状态：优先选择低龄幼苗、组培苗（去除愈伤组织）；其次选择成熟植株的茎尖幼嫩叶片；

（3）取样部位：种子培育的低龄幼苗、组培苗（去除愈伤组织）：全部叶片、部分幼嫩茎；

（4）特殊注意点：对于需要保留茎尖的特殊情况，送样时无法取茎尖组织，可以取紧靠茎尖的第1-2片嫩叶；因为光学图谱对于样品自身杂质含量要求较严格，所以对于富含油脂（如松叶，柏枝等），多糖多酚（如地黄，棉花等）以及富含生物碱（如千层塔等中药材）的植株，最好准备黄化的种子幼苗或者组培苗。

1.3 特殊植物组织样品

（1）特殊植物样品类型：多糖多酚类植物，例如番薯；次生代谢产物较丰富的植物，例如中药材植物；生境潮湿的苔藓或水生植物；

（2）样品制备：由于水生环境或潮湿环境，造成其容易有污染，因此需要注意取样后清理，排除外源污染，适当时需要进行抗生素培养；要求取新鲜幼嫩叶片或嫩芽，避免根茎组织，最好准备黄化的种子幼苗或组培苗。

2. 脊椎动物

2.1 脊椎动物组织样本说明

（1）脊椎动物组织样本主要包括：哺乳动物（人类样本参考6）、禽类、爬行动物以及两栖动物。

（2）送样需要选择新鲜采集的样本，尤其是Ultra long ONT建库，样本的取材优先选择核酸含量相对较高的组织，DNA测序用样本制备优先级：血液>内脏>肌肉。

（3） 组织提取时可能受到上下游处理操作的影响，因此较难保证单次提取满足质量要求，应在寄送组织样品前进行备份。

（4）应在冰上对DNA或RNA样品制备实验的组织样品处理及切割，尽可能快速进行，避免时间过长导致样品降解。

（5）反复冻融和长期保存（-80℃保存时间6个月以上）的组织有高降解风险。寄送样本之前应确保样本没有被反复冻融，特别是动物肝脏，脾脏，肾脏，心脏，脂肪，脑，肿瘤等有较高RNA酶或DNA酶活性的组织。

（6）对肿瘤组织的取材，应尽可能准确地判定肿瘤组织和正常组织，如果有条件，请根据冰冻切片报告的结果来判定要进行研究的取材部位。

2.2 脊椎动物组织样品（不同DNA文库）

2.2.1三代DNA测序

（1）样本类型及送样优先级：

血液、细胞>肾脏>心脏>肝脏>肌肉等（不推荐性腺、脑等组织，代谢快易降解；不推荐耳缘、皮肤等样本，可能存在污染且测序质量差）；

（2）部分物种样本组织量建议（去除包装后的重量）：

（3）样本制备：

a）组织取样前需准备足量液氮，预装样品的15 mL或50 mL冻存管，管盖需钻孔（防止管子内液氮体积膨胀爆炸），并在离心管内加满液氮，进行预冷；

b）组织离体后需快速用预冷的0.9%生理盐水进行漂洗，以去除血渍和污物，并剔除结缔组织和毛发等非研究组织，将样品分割成50 mg左右的小块（约黄豆大小，组织块越小，保存效果越好），用吸水纸吸干后，立即浸入装有液氮的冻存管（螺旋帽的1.5 mL或2.0 mL的冻存管）中彻底冷冻；样品彻底冷冻后，再将样品转至-80℃保存；

c）无法使用冻存管采集保存的样品，离体后仍需将样品立即浸入液氮彻底冷冻，再选用合适的容器包装，包装后需再浸入液氮中彻底冷冻一次，最后将样品转至-80 ℃保存。

d）避免将样品先放入离心管，再将离心管放到液氮中；不建议将样品直接保存于密封袋或不带螺纹旋盖的EP管中，因密封袋经过液氮速冻后变脆易破裂，易导致样品交叉污染，不带螺纹旋盖的EP管容易渗入液氮，导致管内体积膨胀爆管；避免装样太满以至冻裂，造成样品污染。

（4）样本运输：寄送时将样本管放入更大的管或者密封袋中，防止样本运输过程中被破坏，并用大体积干冰运输，保证运输开箱时有足够干冰剩余。

（5）其他：如果计划采用组织内核酸稳定剂保存样本，请严格按照试剂说明书要求规范操作，取材时使组织块保持在试剂要求的大小范围，以保证试剂充分渗透，以免引起降解。

2.2.2 Hi-C测序

（1）样品组织总量：肝脏、肾脏、脑、肌肉等组织>1g；脂肪组织>3g（脂肪组织较难处理，中间损失会较多）；细胞样本>10的6次方个细胞。

（2）样品类型：采集于动物鲜活组织。组织优先级：细胞样本>肾脏>心脏>肝脏>肌肉等。

（3）细胞系样品制备：

a）将组织准备成细胞系：胶原酶消化法制备单细胞悬液，组织处理：彻底去除表皮或毛发等杂质，用酒精擦拭表皮，获取无菌组织；放入加有1%-5% PS的PBS或者DMEM中，多次漂洗（10次左右，越多越好），剔除组织间的血管、结缔组织等，尽量得到纯净的组织，如肌肉，脂肪，真皮等；

b) 破碎组织：将处理干净的组织放入35mm培养皿中，用灭菌处理的剪刀剪碎至1立方毫米的组织碎块（尽量碎），然后转移到15ml的离心管或者灭菌处理的锥形瓶中；加入3-5倍体积的0.1%Ⅰ型胶原酶，37℃消化1h左右，直到组织变粘稠或澄清，观察细胞消化情况；再加入等体积0.25%胰酶消化5-15min，再次观察消化情况，可适当延长胰酶消化时间至20-30 min；将消化好的细胞依次用70 µm和40 µm滤膜过滤组织，得到细胞悬液；过滤后的细胞悬液用1000 rpm转速离心5 min，收集下层细胞；用3-5ml完全培养液重悬细胞，计数。

（4）非细胞悬浮液样品制备：

直接寄送组织：取新鲜的动物组织不低于1g（脂肪不低于3g），放入冻存管中，然后将冻存管放入液氮中速冻30min；如果组织块比较大，可以将组织放入密封袋中，然后用锡箔纸包裹起来，放入液氮中速冻30min；液氮速冻之后，转至-80℃保存。可参考2.2.1中“（3）样本制备”过程描述。

（5）样本运输：寄送时将样本管放入更大的管或者密封袋中，防止样本运输过程中被破坏，并用大体积干冰运输，保证开箱验收时有足够干冰剩余。

2.2.3 BioNano测序

（1）样本量：组织量30-50mg/管，送2管。

（2）样品类型：建议优先选择新鲜血液；其次是选择较嫩的器官，优先选择脾脏，肝脏，肾脏。

（3）样品运输：

a）冷冻前组织需要是新鲜的，从未解冻过的。如果组织已经大块冷冻，可切下30-50mg送样，操作全程需保持整块组织冷冻(可在液氮或干冰环境下进行切割)。如果不能切割，可整块组织送样，如有需要可安排后续返样。

b）将30-50mg组织块放入离心管或冻存管中，每管一块组织。如果组织新鲜，先切到合适的量后放到管中再速冻整管。将组织放入事先预冷的离心管中，液氮速冻，确保组织不会黏住管壁难以取出。

c）冻存管中的样本可放置在-80度冰箱保存，需要邮寄时干冰运输。

注：Bionano一次提取至少需要10mg左右的组织，不同组织类型提取投入量可能不同。

3 节肢动物

3.1 节肢动物组织样本说明

（1）节肢动物主要包括昆虫以及虾蟹类动物。

（2）送样需要选择新鲜采集的样本，尤其是三代超长片段建库。某些吸血性昆虫，例如蚊子，血吸虫，该类型样本可能存在外源污染，需要进行切腹，去除肠道处理。

（3） 组织提取时可能受到上下游处理操作的影响，因此较难保证单次提取满足质量要求，建议进行备份。

（4）取样操作需在冰上进行，避免样本的冻融。

（5）反复冻融和长期保存的组织有更多的降解风险。

（6）液氮冷冻方式是多数组织样品选取的处理方法，详解如下：

a）组织取样前需准备好冷冻组织的足量液氮，预装样品的15 mL或50 mL冻存管，管盖需钻孔（防止管子内液氮体积膨胀爆炸），并在离心管内加满液氮；

b）组织离体后需快速清洗，立即浸入装有液氮的冻存管中彻底冷冻（避免将样品先放入离心管，再将离心管放到液氮中）；样品彻底冷冻后，再将样品转至-80℃保存；

c）无法使用冻存管采集保存的样品，离体后仍需将样品立即浸入液氮彻底冷冻，再选用合适的容器包装，包装后需再浸入液氮中彻底冷冻一次，最后将样品转至-80 ℃保存。

3.2 节肢动物组织样本

3.2.1 三代DNA测序

（1）例如蚂蚁、蚊子等个体较小的昆虫，进行体表清洁去除污染后，可直接放入冻存管中，液氮速冻；

（2）例如蜜蜂、毛毛虫等个体较大的昆虫，解剖取活体组织后，用预冷0.9%生理盐水清洗后，吸干体表液体。将组织样本分成约50 mg左右。液氮速冻后，放入干净的冻存管中；

（3）甲壳类节肢动物，例如对虾、螃蟹等，预冷0.9%生理盐水清洗活体组织，解剖后选取软组织，切割成50 mg的组织块（约黄豆粒大小），液氮速冻后置于冻存管中；

（4）所有样本均需经液氮速冻后置于-80℃低温保存，并选择干冰运输寄送样本。

3.2.2 Hi-C测序

（1）样品类型：采集于动物鲜活组织。

（2）样品运输：取新鲜的组织不低于1g，放入冻存管中，然后将冻存管放入液氮中速冻30min；如果组织块比较大，可以将组织放入自封袋中，然后用锡箔纸包裹起来，放入液氮中速冻30min；液氮速冻之后，转至-80℃保存。

注：寄送组织时需要用足够的干冰，以保证组织在途中不融化。

3.2.3 BioNano测序

卵或幼虫，液氮速冻，-80℃保存，干冰运输，总量1g/管，送2管。

4 水产类

4.1 水产类组织样本说明

（1）水产类包括淡水鱼类、海水鱼类、贝类、藻类。

（2）送样需要选择新鲜采集的样本，尤其是三代超长片段建库。海水类物种需要进行淡化处理。

（3）组织提取时可能受到上下游处理操作的影响，因此较难保证单次提取满足质量要求，应进行备份。

（4）取样操作需在冰上进行，避免样本的冻融。

4.2 水产类组织样本

4.2.1 三代DNA测序

（2）样本类型：

样品采集时建议活体取材后用预冷的0.9%生理盐水进行漂洗，以去除血渍和污物，将样品分割成50 mg左右的小块（约黄豆大小，组织块越小，保存效果越好），样品分割和处理时应尽量在冰上进行，防止样品降解。避免装样太满以至冻裂，造成样品污染。

（3）藻类样本：

大型藻类送样量（干重）不少于3g，单细胞藻类（干重）不少于1g。建议藻类可提前使用抗生素处理。

注：水产类样品需尽量保证为新鲜个体。尽量避免寄送保存时间较长或经过反复冻融的组织样品。针对软体动物可先使用75%的乙醇进行漂洗，无菌水去除酒精残留后液氮冷冻，干冰运输；针对刺胞动物，可去除头部和肠道等部位，保留肌肉外壁用于提取。

4.2.2 Hi-C测序

（1）动物组织样本类：

（a）样品类型：采集于动物鲜活组织。

（b）样品运输：取新鲜的组织不低于1g，放入冻存管中，然后将冻存管放入液氮中速冻30min；如果组织块比较大，可以将组织放入自封袋中，然后用锡箔纸包裹起来，放入液氮中速冻30min；液氮速冻之后，转至-80℃保存。

注：寄送组织时需要用足够的干冰，以保证组织在途中不融化。

（2）单细胞藻类样本：

（a）需要量：最低要求每次2×10⁶ ，每份不超过2×10⁷个细胞。请注明样品提交表格每个样品细胞的总数量。建议发送多份（2-3）样品，允许重复提取。 

（b）样品准备：选择新鲜的单细胞藻类，使之保持存活。

（c）运输方式（室温）：将藻类置于培养液中，用隔温容器运输（为避免极端的外界温度影响），运输时间12小时~2天。

4.2.3 BioNano测序

（1）藻类样本：单细胞藻类按照1个plug需要包埋9x10⁵，如果包埋5 plug，建议细胞量为5x10⁶个。

（2）组织样本：选择娇嫩的组织部位。取出的组织液氮速冻，-80℃保存，干冰运输。组织量500mg/管，送两管。

（3）鱼类血液样本：新鲜采取的血液，要加抗凝剂，抗凝剂可以根据客户自己平常的研究来确定。血液一般需求量为100ul/管，送2管。采样后，请妥善-80℃保存好，运输到实验室前不能有过冻融。取好的样品一周内送到实验室，超过一周请重新准备样本。

5 血液样本

5.1 血液样本说明

新鲜血样或是冻存血样均需要使用EDTA抗凝管进行采集并与抗凝剂充分混合，血液样本不建议保存时间过长。

5.2 三代DNA测序

（1）样本用量

（2）要求为全血样本，并加入抗凝剂，推荐使用EDTA抗凝的采血管收集样品（由于会影响实验，不能使用肝素抗凝），并将其放入50ml离心管中(以防冻存过程中发生采血管冻裂，导致血液损失)；-80℃冷冻后，干冰运输。

（3）血液样本一定要避免反复冻融，如果血液放置时间过长，或经历过反复冻融，请务必提前沟通，以尽量保证血液样本核酸提取质量。因放置过久或经历过反复冻融的样本经常会发生细胞核破裂，核酸游离于血浆中。

（4）血液样品应使用塑料材质的采血管送样，避免使用玻璃材质采血管送样或装液太满，以至冻裂。

（5）新鲜血液样本：推荐 EDTA 抗凝采血管收集样品，或加EDTA或柠檬酸钠抗凝剂保存，4℃保存，冰袋运输（需在1天内送到）。

（6）加入抗凝剂后的新鲜血液一般可以在4℃放置12-24小时，但经过速冻后的样本一定要低温保存。

5.3 Hi-C测序

（1）样品总量：全血需提供分离并固定好的淋巴细胞，细胞量≥2.0×10⁶/次。

（2）所需试剂：37%甲醛（sigma），Glycine(amresco)，Lymphoprep(Stemcell)。

（3）分离淋巴细胞:

a）取15ml Lymphoprep于50ml离心管中，将2ml的新鲜血液缓慢平铺于上层（平铺血液时将离心管倾斜一定角度缓慢注入，避免两种液体混合在一起），800g 4℃离心20min。

b）经离心后，液体分层，PBMC所在的细胞层为白色，用移液器小心吸取该层细胞将其转移到干净的50ml的离心管中，避免吸到红细胞层。

c）加入1xPBS至30ml，300g，10min离心去上清；加入少量1xPBS，用手指轻弹重悬沉淀后再加满至30ml，5000g离心5min后去上清；重复一次。

d）加入1xPBS至10ml，进行细胞计数。（细胞数量需要≥2M）。

（4）固定：

a）在10ml的细胞悬液中，加入571µl 37%甲醛混匀（终浓度为2%），室温放置15min（每1、2分钟混匀一次）。加入1.14mL 2.5M甘氨酸混匀终止交联，室温放置5min，（每1、2分钟混匀一次），然后冰上放置15min。

b）将细胞悬液用500g 4℃离心10min，弃上清，细胞沉淀可以储存在-80℃。

（5）干冰寄送：寄送细胞时需要足够的干冰，以保证细胞在途中不融化。

5.4 BioNano测序

5.4.1 血液（动物或人）样本

（1）当新鲜血液采集后运输并可在5天内运达诺禾的话，请参照如下指导：

a）用EDTA管采集血液。采集后的血液可放置到采血管混匀仪室温混匀15min，或手动轻柔缓慢颠倒混匀15次，确保无凝血现象。保证与抗凝剂的充分混匀，确保无凝血现象。

注：Bionano提取需要1.5×106个白细胞作为提取的起始量。全血样本与抗凝剂充分混合，避免凝血现象，保证足够的白细胞数量，是全血样本提取成功的关键。

b）采血用封口膜封口后保存在4℃，使用4℃冰袋运输（请勿使用-20℃冰袋）。

（2）新鲜血液打包运输指南

a） 将采血管放入密封袋中，密封袋内放置吸水纸（目的是吸附意外泄露的血液）。切勿用纸巾包裹采血管。

b） 使用泡泡纸松松地包裹密封袋。不要用胶带直接包裹或钉密封袋。

c） 将打包好的采血管放入体积足够的聚苯乙烯泡沫箱中，放入足够的冰袋（4℃），保证运输过程低温。如有需要，加入缓冲材料。使用最快速的运输服务进行运输。

（3）冷冻血液采集及预处理指南

推荐将采集后充分抗凝的血液进行分装，以便进行后续储存和运输。每管分装650ul-1ml全血（针对不含有带核红细胞的血液）。一次提取仅需要一管分装血液，推荐额外送样一管作为备份。

将血液进行分装，每个冻存管分装650ul-1ml血液。将每份血液尽快放到-80℃冰箱冷冻。如条件不具备的话，最晚在采血后4天内完成冷冻。

注：如果血液已经冷冻，切勿为了分装而解冻。可将整管血液送样，如有需要可安排返样。冷冻全血样本需要保证从冷冻之日起，恒定保存在-80℃，没有经历过样本化冻。

（4）冷冻血液打包运输指南

a） 分装后的冷冻管口需用封口膜包裹，将所有样品管放到密封袋中；

b） 用泡泡纸松松地包裹密封袋，不要用胶带直接包裹或钉密封袋。

c） 使用可放下合适体积的干冰和样品的聚苯乙烯泡沫箱，确保运输过程干冰量足够。使用最快速的运输服务进行运输。

5.4.2 鱼血（或水生动物血液）样本

新鲜采取的血液，要加抗凝剂，抗凝剂可以根据自己平常的研究来确定。采样后，请妥善-80℃保存好，运输到实验室前不能有过冻融。取好的样品一周内送到实验室，超过一周请重新准备样本。

6 人

6.1人组织样本说明

(1)送样需要选择新鲜组织或冰冻组织，尽量选择新鲜组织，尤其是三代超长片段建库。

(2)组织提取时可能受到上下游处理操作的影响，因此较难保证单次提取满足质量要求，应在寄送组织样品前进行备份。

(3)用于DNA或RNA样品制备实验的组织样品处理及切割过程应在冰上尽可能快速进行，时间过长会导致样品降解。

(4)反复冻融和长期保存的组织有更多的降解风险。应确保寄送之前组织没有被反复冻融，特别是肝脏，脾脏，肾脏，心脏，脂肪，脑，肿瘤等有较高RNA酶或DNA酶活性的组织。

(5)癌症研究需同时取肿瘤样本和正常对照。肿瘤样本尽量保证组织中恶性肿瘤细胞所占比例较大，至少超过50%。正常对照首选血液样本，次选癌旁对照。

(6)对肿瘤组织的取材，应尽可能准确地判定肿瘤组织和正常组织，如果有可能请根据冰冻切片报告的结果来判定要进行研究的取材部位。

(7)液氮冷冻方式是多数组织样品选取的处理方法，详解如下：

a）组织取样前需准备好冷冻组织的足量液氮，预装样品的15 mL或50 mL冻存管，管盖须钻孔（防止管子内液氮体积膨胀爆炸），并在离心管内加满液氮；

b）组织离体后需快速清洗，立即浸入装有液氮的冻存管中彻底冷冻（避免将样品先放入离心管，再将离心管放到液氮中）；样品彻底冷冻后，再将样品转至-80℃

c）无法使用冻存管采集保存的样品，离体后仍需将样品立即浸入液氮彻底冷冻，再选用合适的容器包装，包装后需再浸入液氮中彻底冷冻一次，最后将样品转至-80℃保存。

6.2 人组织样本

6.2.1 三代DNA测序

(1)样本量：样本总量（干重）：1-2g（切成约黄豆粒大小）。细胞系样本：不低于5*10的6次方个细胞。

(2)部分样本类型或组织部位送样建议：

(3)组织大小实例：

(5)组织样本准备：采集组织后立即用预冷的0.9%生理盐水进行漂洗，以去除血渍和污物，并剔除结缔组织和毛发等非研究组织，将样品分割成 50 mg左右的小块（约黄豆大小，组织块越小，保存效果越好），立即液氮速冻，冻存后放入预冷的带螺旋帽的1.5 mL或2.0 mL的冻存管中（不建议将样品直接保存于密封袋或不带螺纹旋盖的EP管中，因密封袋经过液氮速冻后变脆易破裂，易导致样品交叉污染，不带螺纹旋盖的EP管容易渗入液氮，导致管内体积膨胀爆管），然后用封口膜封口，-80℃保存。样品分割和处理时应尽量在冰上进行，防止样品降解。避免装样太满以至冻裂，造成样品污染。

(6)细胞样本准备：液氮慢冻或收集得到细胞沉淀，液氮速冻，加细胞冻存液（血清+10% DMSO）。

(7)样本运输：寄送时将样本管放入更大的管或者自封袋中，防止样本运输过程中被破坏，并用大体积干冰运输，保证开箱时有足够干冰剩余。

(8)其他：如果计划采用组织内核酸稳定剂保存样本，请严格按照试剂说明书要求规范操作，取材时使组织块保持在试剂要求的大小范围，以保证试剂充分渗透，以免引起降解。

6.2.2 Hi-C测序

(1)样品总量：肝脏、肾脏、脑、肌肉等组织不低于1g；脂肪组织不低于3g（脂肪组织较难处理，中间损失会较多）；细胞样本：不低于10的6次方个细胞。

(2)样品类型：采集于新鲜组织。组织优先级：细胞样本>肾脏>心脏>肝脏>肌肉等。

(3)样品运输：

a）直接寄送组织：取新鲜的组织不低于1g（脂肪不低于3g），放入冻存管中，然后将冻存管放入液氮中速冻30min；如果组织块比较大，可以将组织放入自封袋中，然后用锡箔纸包裹起来，放入液氮中速冻30min；液氮速冻之后，转至-80℃保存。

b）将组织准备成细胞系：胶原酶消化法制备单细胞悬液，组织处理：彻底去除表皮毛发等杂质，用酒精擦拭表皮，获取无菌组织；放入加有1%-5% PS的PBS或者DMEM中，多次漂洗（10次左右，越多越好），剔除组织间的血管、结缔组织等，尽量得到纯净的组织，如肌肉，脂肪，真皮等；

c) 破碎组织：将处理干净的组织放入35mm培养皿中，用灭菌处理的剪刀剪碎至1立方毫米的组织碎块（尽量碎），然后转移到15ml的离心管或者灭菌处理的锥形瓶中；加入3-5倍体积的0.1%Ⅰ型胶原酶，37℃消化1h左右，直到组织变粘稠或澄清，观察细胞消化情况；再加入等体积0.25%胰酶消化5-15min，再次观察消化情况，可适当延长胰酶消化时间至20-30 min；将消化好的细胞依次用70 µm和40 µm滤膜过滤组织，得到细胞悬液；过滤后的细胞悬液用1000 rpm转速离心5 min，收集下层细胞；用3-5ml完全培养液重悬细胞，计数。

注：寄送组织时需要用足够的干冰，以保证组织在途中不融化。

6.2.3 BioNano测序

(1)样本量：组织量30-50mg/管，送2管。

(2)样品类型：建议优先选择新鲜血液；其次是选择娇嫩的器官，优先选择脾脏，肝脏，肾脏。

(3)样品运输：

a）冷冻前组织需要是新鲜的，从未解冻过的。如果组织已经大块冷冻，可切下30-50mg送样，操作全程需保持整块组织冷冻(可在液氮或干冰环境下进行切割)。如果不能切割，可整块组织送样。

b）将30-50mg组织块放入离心管或冻存管中，每管一块组织。如果组织新鲜，先切到合适的量后放到管中再速冻整管。将组织放入事先预冷的离心管中，液氮速冻，确保组织不会黏住管壁难以取出。

c）冻存管中的样本可放置在-80摄氏度冰箱保存，需要邮寄时干冰运输。

注：Bionano一次提取至少需要10mg左右的组织，不同组织类型提取投入量可能不同。

7 ONT Ultra Long样本

7.1 人血液样本

（1）采血前注意事项：

护士采血前，注意远端使用采血绷带，切忌拍打采血着的血管，避免溶血。 一定使用抗凝管，凝血会导致提取结果极差。

（2）血液采样：

抽取血液保存至5ml EDTA抗凝管（紫盖）中，轻柔8字混匀5次左右，使血液与抗凝剂充分混合，建议液氮速冻10min以上，然后转移至干冰做短期保存或者-80℃长期保存（建议少于1个月）。（如条件不允许也可以采血后直接使用干冰冻存）

注：为防止爆管及碎管建议每个5ml抗凝管取2ml血液，采用塑料材质抗凝管，并在运输前将抗凝管做简单保护（使用报纸或者柔性纸）装入50ml的离心管中，以免运输途中爆管导致样本损失。

（3）送样量：

推荐送样量≥3ml/cell，并推荐做额外备份一管。

（4）样本注意事项：

血液样本一定要避免反复冻融，如果血液放置时间过长，或经历过反复冻融，请务必提前沟通，以尽量保证血液样本核酸提取质量。因放置过久（4℃或以上温度放置时间超过4h）的样本经常会发生细胞核破裂，核酸游离于血浆中。

采血所需耗材及器械

7.2 植物样本

（1）植物样本主要包括禾本科植物、十字花科、常见作物、林木、常见蔬菜和花卉等。

（2）样本选择：优先选择核酸含量相对较高的组织，新鲜幼嫩的组织最佳，如幼叶，幼芽。Ultra long ONT样本需求为新萌发的叶片，成熟植物新发芽叶片仅适用于50K文库，100K、200K文库效果较差。由于组培苗的愈伤组织DNA不稳定，组培苗在个别分析中不建议使用。

（3）样本制备：选取幼嫩无病虫害的组织部位，新鲜组织摘取后，立即进行表面消毒，并依次使用75%酒精冲洗-无菌水冲洗，用吸水纸吸干多余水份（操作迅速）。液氮冻存前，进行分装。将组织放入预冷的冻存管、15ml或50ml离心管或者自封袋中，液氮速冻，然后-80℃保存。

（4）活体样本运输：选取幼嫩活体植株进行打包处理，减少运输途中对植物造成的伤害。

（5）冷冻样本运输：如用锡箔纸包装组织样品，折叠时需有纹理可循，并将锡箔纸放入自封袋中，避免打开锡箔纸时样品洒落；将样本完全埋入干冰中，避免反复冻融。

注：黄化处理建议在采集样本之前，将样本置于黑暗环境24-48小时后再制备样本，该操作有利于提高核酸提取得率，可获得更高质量的核酸。

送样量：

幼嫩叶片 ≥3g/cell

7.3 动物样本

（1）动物组织样本主要包括：哺乳动物、禽类、爬行动物、两栖动物、贝类及鱼类。

（2）样本选择：优先选择核酸含量相对较高的组织，对于动物样本优先选取血液或细胞系，可制备100K及以上文库，内脏或肌肉组织，可制备50K文库。

（3）样本制备：

a）血液样本：抽取血液保存至抗凝管（紫盖）中，缓慢摇匀使血液与抗凝剂充分混合，液氮速冻，-80℃保存。

注：为防止爆管及碎管建议5mL抗凝管取2mL血液，并采用塑料材质抗凝管，并在运输前将每个抗凝管装入更大一号的离心管中，以免运输途中爆管导致样本损失。一定使用抗凝管，凝血会导致提取结果极差。

b）细胞样本：收集细胞后，用PBS清洗1-2次，液氮速冻，-80℃保存。

c）肌肉或内脏组织：在冰上对组织样品处理及切割（肌肉组织每份约1g，内脏组织每份约0.05g），尽可能快速进行，避免时间过长导致样品降解，切分后装入冻存管迅速液氮速冻，-80℃保存。

注：组织提取时可能受到上下游处理操作的影响，因此较难保证单次提取满足质量要求，应在寄送组织样品前进行备份。

（4）冷冻样本运输：将样本埋入干冰中进行运输，避免反复冻融。

送样量：

哺乳动物血液≥3mL/cell，

细胞≥6x10⁶/cell，

有核红细胞血液（包括鱼类、爬行类、两栖类、家禽类、鸟类）≥20ul/cell，

肌肉组织≥2g/cell，内脏组织（肾、脾、肝等）≥0.1g。

肌肉、内脏组织分管保存

7.4 真菌样本

(1)样本量：菌体≥3g，-80℃保存，干冰寄送。 (2)样本准备：真菌（100mL）菌液，4000×g 离心 10min（4℃），弃上清，沉淀用无菌水洗 2 次后干冰送样，若是新鲜真菌建议 3g 以上，建议送 2-3个平行，避免一次提取不成功。 (3)注意事项：

a）甘油保存，需要重新液体培养基（例如 LB）活化到对数期，不可直接送甘油保存的菌株；

b）不建议送固体培养皿的菌，如是只有固体培养基才能活，可以刮到有 PB 缓冲液的离心管里面，离心，送沉淀 2g 以上；

c）真菌（5g）大型菇类等，建议送菌丝，不建议送孢子或是子实体，杂合率较高，不利于组装；

d）样本一定为非灭活样本，灭活会导致核酸严重降解。

8 核酸样本（DNA）

8.1 核酸样本说明

8.1.1 核酸样本检测方法

在核酸样本寄送前，需提供样本基本质控结果，常见样本质控包括Qubit®、NanoDropTM、AGE（琼脂糖凝胶电泳）或者Agilent 2100中一种或多种形式的样品分析结果。

8.1.2 核酸样本检测项目及说明

v：体积（Volume），样品（溶液）体积。

m：总量（Total Mass），DNA或RNA总量。

c：浓度（Concentration），DNA或RNA浓度。

28S/18S：28S/18S比值，真核生物rRNA中28S与18S比值，反映真核RNA完整性。

28S/16S：28S/16S比值，原核生物rRNA中28S与16S比值，反映原核RNA完整性。

OD260/280：OD260/280比值，DNA或RNA检测中260与280吸光度值比，反映DNA或RNA纯度。

OD260/230：OD260/230比值，DNA或RNA检测中260与230吸光度值比，反映DNA或RNA纯度。

样品分类

Pass：合格，质量满足三代建库要求。

Fail：样品质量不满足建库测序要求，不建议使用。

8.1.3 核酸样本制备要求

(1) 提取好的基因组 DNA 应溶解于不含有 EDTA 的 PH 8.0 缓冲液中，可溶解于 10mM Tris-Ac、Tris-HCl 或 ddH2O 中。

(2) 样品溶液澄清无色，无不可溶解物质，无 RNA 污染。

(3) 不含螯合剂（如 EDTA），二价金属阳离子（如 Mg2+），变性剂（如胍盐, 苯酚）、去污剂（如SDS，Triton-X100），不含生物组织中的污染物（如血红素、腐殖酸、多酚）。

(4) 样品避免接触紫外线、荧光染料等可能损伤 DNA， 如过样本需要切胶纯化， 请使用 SYBR®Safe (Invitrogen) 染料并使用蓝光成像。

(5) 样品不要暴露在高温（＞65℃ 1 h 以上）或极性环境中（pH＜6 或 pH＞9） 如果样本来源生物的生存环境属于极端环境。

(6) 样品切忌反复冻融，运输过程务必全程保持低温4℃。

(7) 风险与建议：

总量不足或浓度过低存在以下风险：

a）文库构建可能失败；

b）文库产量低不能上机测序或测序数据不足；

c）影响文库随机性、数据覆盖度偏低。

降解样品：影响文库随机性，可造成duplication偏高等。

8.2 三代建库

由于三代测序对样本质量要求较高，请务必按照以下送样标准，并仔细纯化样本，尽量避免多糖、蛋白质等残留。样本需要标注溶剂成分，溶解DNA的缓冲液不可含有EDTA，核酸样本不许含有以下物质：颗粒物质、螯合剂、二价金属阳离子、变性剂和洗涤剂、荧光染料，不得是EB凝胶回收产物。