三代微生物测序

1. 三代微生物

1.1 单菌组织样本（细菌，真菌）

(1)样本量：菌体≥3g，-80℃保存，干冰寄送。

(2)样本准备：对数期细菌（50ml）菌液，4000×g 离心 10min（4℃），弃上清，沉淀（离心后至少3g）用无菌水洗 2 次后干冰送样，建议送 2-3个平行，避免一次提取不成功。

真菌（100mL）菌液，4000×g 离心 10min（4℃），弃上清，沉淀用无菌水洗 2 次后干冰送样，若是新鲜真菌建议 3g 以上，建议送 2-3个平行，避免一次提取不成功。

(3)提取成功的样品类型：鲍曼不动杆菌，沃氏葡萄球菌，肠炎沙门氏菌，埃希氏菌，粪肠球菌，葡萄球菌，不动杆菌，放线菌，链霉菌等。

(4)注意事项：

a）甘油保存，需要重新液体培养基（例如 LB）活化到对数期，不可直接送甘油保存的菌株；

b）不建议送固体培养皿的菌，如是只有固体培养基才能活，可以刮到有 PB 缓冲液的离心管里面，离心，送沉淀 2g 以上；

c）真菌（5g）大型菇类等，建议送菌丝，不建议送孢子或是子实体，杂合率较高，不利于组装；

d）样本一定为非灭活样本，灭活会导致核酸严重降解。

1.2 三代扩增子组织样本

(1)样本量：

(2)样本运输：-80℃保存，干冰寄送。

(3)提取成功的样品类型

1.3 三代宏基因组组织样本

(1)样本量：

(2)样本运输：-80℃保存，干冰寄送。

(3)提取成功的样品类型： 土壤、水体、粪便、肠道内容物、发酵液等。

1.4 核酸样本（微生物）

1.4.1 单菌DNA送样量要求

（1）纯度要求：OD260/280=1.8~2.0，DNA 条带单一，无杂带，无 RNA、蛋白质等杂质污染；（2）样品浓度和总量要求：

（3）细菌和真菌 DNA 样本，请老师首先进行污染排查检测和物种鉴定，污染排查和物种鉴定方法：细菌可以扩增 16s 全长后送一代测序，真菌还需扩增 ITS全长，确定物种正确，无其他杂菌污染再送样。

（4）注意事项：

①菌液应当为对数生长时期；

②霉菌和蕈菌可能存在二倍体杂合度比较高的情况，而且也可能包含其他杂菌，如果直接提取 DNA 送样，会影响后续染色体组装效果，建议先进行纯化培养，多传几代，可以取孢子分离纯培养，然后再提取 DNA 送样。

1.4.2 三代扩增子DNA送样量要求 

1.4.2.1 DNA样本

（1）样品浓度：DNA≥10 ng/μL，总量：DNA≥150 ng；

（2）需提供电泳图；

（3）送样时请使用干冰或冰袋运送（建议用干冰）；

（4）DNA 要有明显主带，无降解，无 RNA、蛋白质等杂质污染。

1.4.2.2 PCR样本（包cell）

（1）PCR产物浓度≥20 ng/μL，PCR 产物总量≥2μg(支持1次文库构建）；

（2）PCR产物要经过纯化（如胶回收纯化），确保条带单一，无降解，无引物二聚体；

（3）PCR 产物需带有双端Barcode序列（注意区别于二代barcode序列，每个样本有成套barcode序列）；

（4）需提供电泳图；

（5）送样时请使用干冰或冰袋运送。

1.4.3 三代宏基因组DNA送样量要求

（1）样品总量：DNA浓度 ≥80 ng/μL，DNA总量≥5 μg（nanopore平台）或 DNA总量≥10 μg（Pacbio平台）；

（2）纯度要求：OD260/280=1.8-2.0，无 RNA、蛋白质等杂质污染；

（3）注意事项：人或动物组织样本宏基因组，要避免宿主DNA的污染，如果宿主基因组序列占环境DNA比例较高，测序后得到的有效数据量很低，且我们无法通过已知宿主基因组序列去污染，会对后续分析结果造成较大影响。建议可通过以下方法尽量避免宿主DNA的污染：

① 取样时，尽量不要取靠近组织的部位；

② 提取时，采用适用于样本类型的 DNA 提取试剂盒；

③ 如果宿主有参考基因组，可以通过比对去除宿主基因组污染。

1.4.4 样本检测方法

(1) Invitrogen Qubit®Fluorometer

(2) Agarose Gel Electrophoresis

(3) NanoDropTM/酶标仪

(4) Agilent 2100 Bioanalyzer

1.4.5 样本检测使用量