1. 细胞类样本

1.1 贴壁细胞

样本类型送样量样本保存和运输
冻存贴壁细胞

>40万/份,建议送备份

冻存前活性>90%

复苏后活性>80%

冻存液冻存后将冻存管置于密封袋中,液氮保存,干冰运输。
新鲜贴壁细胞

>20万/份,建议送备份

活性>80% 

至少提前2天预约实验;

  

冻存贴壁细胞处理方法:

(1)取出贴壁细胞,显微镜下观察,确定生长状态是否良好,是否有细菌污染;

(2)吸掉培养基,向细胞培养瓶/皿中加入适量1×PBS(体系中不可含Mg2+和Ca2+)洗2次;

(3)弃尽PBS,加入适量胰酶放回37℃培养箱中消化,消化时间根据细胞类型进行调整,以显微镜下观察细胞是否分散作为调整标准;

(4)加入5ml含血清的完全培养基终止消化,用吸管轻轻地吹下贴壁细胞,500g离心5min,小心去上清;

(5)加入1×PBS(体系中不可含Mg2+和Ca2+)清洗一次,4℃ 500g离心5min,弃上清;

(6)加入1ml配制好的冻存液(80%完全培养+10%FBS+10%DMSO)(百分比指体积比)重悬细胞沉淀,按照建议送样量分装,移至冻存管(请提前配置细胞冻存液且置于冰上预冷,防止新配置的冻存液过热损伤细胞,待冻存液恢复室温后使用);

(7)将冻存管置于程序降温冻存盒,于-80℃冰箱梯度降温并暂时保存(请严格按照程序降温来操作,对细胞造成的损伤最小)。24h后,请将程序降温盒中的细胞样本转移至液氮中保存。若没有程序降温冻存盒,建议使用人工传统降温方法:冻存管置于4℃ 10min→-20℃ 30min→-80℃ 16-18h(或过夜,最长放置不超过一个月)→转移至液氮长期储存。

新鲜贴壁细胞处理方法:

(1)确定生长状态良好且无污染;

(2)吸掉培养基,加入适量 1×PBS(体系中不可含 Mg2+和 Ca2+)洗 2 次,吸尽培养基;

(3)小心吸除 PBS,加入适量胰酶,37℃培养箱中消化,消化时间和方式请根据细胞类型进行调整,以显微镜下观察细胞是否分散作为调整标准;

(4)加入 5 mL 含血清的完全培养基终止消化,用吸管轻轻地吹下贴壁细胞,500×g 离心 5 min,小心去上清;

(5)加入 1×PBS(体系中不可含 Mg2+和 Ca2+)清洗一次,4℃ 500×g 离心 5 min,弃上清;

(6)用 1 ml 以上的培养基/血清重悬细胞沉淀,转移至 2 ml 离心管中,用 parafilm 对离心管进行密封。

1.2 悬浮细胞

样本类型送样量样本保存和运输
冻存悬浮细胞 

>40万/份,建议送备份

冻存前活性>90%

复苏后活性>80% 

冻存液冻存后将冻存管置于密封袋中,液氮保存,干冰运输。
新鲜悬浮细胞 

>20万/份,建议送备份

活性>80%

至少提前2天预约实验


冻存悬浮细胞处理方法:

(1)取出悬浮细胞于显微镜下观察,确定培养细胞生长状态是否良好,是否有细菌污染;

(2)收集细胞,进行细胞计数,4℃ 500×g离心5min,小心弃上清;

(3)加入1ml 1×PBS(体系中不可含Mg2+和Ca2+)重悬细胞沉淀,清洗一次,4℃ 500×g离心5min,小心弃上清;

(4)加入1ml配制好的冻存液(80%完全培养+10%FBS+10%DMSO)(百分比指体积比)重悬细胞沉淀,按照建议送样量分装,移至冻存管(请提前配置细胞冻存液且置于冰上预冷,防止新配置的冻存液过热损伤细胞,待冻存液恢复室温后使用);

(5)将冻存管置于程序降温冻存盒,于-80℃冰箱梯度降温并暂时保存。24h后,请将程序降温盒中的细胞样本转移至液氮中保存。若没有程序降温冻存盒,建议使用人工传统降温方法:冻存管置于4℃ 10min→-20℃ 30min→-80℃ 16-18h(或过夜,最长放置不超过一个月)→转移至液氮长期储存。

新鲜悬浮细胞处理方法:

(1)确定细胞生长状态良好且无污染;

(2)进行细胞计数,每样本取 20 W 个细胞以上,细胞悬液 4℃ 500×g 离心 5 min,小心去上清,离心条件可根据细胞类型进行调整;

(3)加入 1 mL 1×PBS(体系中不可含 Mg2+和 Ca2+) 重悬细胞沉淀,清洗一次,4℃ 500×g 离心5 min,小心弃上清;

(4)用 1 ml 以上的培养基/血清重悬细胞沉淀,转移至 2 ml 离心管中,用 parafilm 对离心管进行密封。

2. 动物组织

样本类型送样量样本保存和运输
动物组织

常见组织类型40mg

心、肾、神经等组织类型50mg


备份1-2份 置于密封袋中,液氮速冻,干冰运输。

  

 


动物组织处理方法:

(1)取新鲜组织,立即剔除结缔和脂肪组织等杂质;

(2)将组织转移至新离心管中,用预冷的PBS溶液漂洗至将组织表面的残留血液冲洗干净。(肌肉组织不易清洗,建议增加漂洗次数);

(3)将冲洗干净的组织样本取出并用无尘纸擦干水分,若组织体积较大,应在冰上将组织切成小块或薄片(每份约50mg),之后置于2ml旋盖冻存管内,准备标记样本名称;

(4)迅速置于液氮中冷冻30-60min,然后转移至-80℃冰箱中保存。

3. 植物组织

样本类型送样量 样本保存和运输
植物组织 

幼嫩的组织叶片0.3g

种子、根等特殊组织部位0.5~1g

植物组织建议送一份备份 

置于密封袋,液氮速冻,干冰运输。

建议选取幼嫩的叶片,种子、根等。

 

植物组织处理方法:

(1)从植物体上取下新鲜组织,后用清水将材料表面的灰尘或泥土冲洗干净,吸干;

(2)如果组织体积较大,应在冰上将组织切成小块或薄片,然后放入2ml或更大体积的旋盖冻存管中,每份>300mg,准备标记样本名称;

(3)立即浸入液氮中速冻30min,之后保存于-80℃冰箱。

4. 其他类型样本

样本类型送样量
自建库

文库体积≥15μl;

文库QPCR检测,摩尔浓度大于2nmol/L;

文库AATI检测,合格文库的峰型特点是:无接头、峰型正常(200bp起峰,之后有规律性起伏,无小片段)。

 

 

5. 注意事项

(1)确保细胞样本无外源污染,CUT&Tag建库不对样本进行污染源检测。

(2)以下全程操作体系中,不可含Mg2+和Ca2+,会影响Tn5酶的效率。

(3)原代细胞、经流式分选等初始活性较低的细胞样本,需评估。

(4)结缔组织、脂肪组织、血液、皮肤、毛发等特殊组织部位,需评估。

(5)细菌、真菌类样本需评估。

(6)收集好的样品放到离心管或EP管(不建议将样品直接装入密封袋),干冰运输并录样为【RNA组织】。

(7)【勿】使用RNAlatter、TRIzol、酒精保存。